通过构建肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)基因敲除小鼠的抗磷脂综合征(APS)血栓模型，系统阐明PAD4在中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成及血栓发生中的关键作用，为研究APS的发病机制及治疗提供新的思路。

本研究采用C57BL/6野生型小鼠及PAD4基因敲除(PAD4-/-)小鼠构建实验体系，将25只小鼠随机分为5组：空白对照组(BLK组)、抗磷脂综合征模型组(APS-MG组)、PAD4特异性拮抗剂GSK484干预组(GSK484组)、PAD4-/-造模组(PAD4-/-组)、PAD4-/-造模鼠+野生型小鼠中性粒细胞过继回输解救组(PAD4-/-＋PR组)。通过尾静脉注射APS 患者血浆纯化的抗磷脂抗体IgG(APS-IgG)联合下腔静脉结扎术，建立APS相关静脉血栓小鼠模型，GSK484组于术前给予PAD4特异性拮抗剂GSK484干预，PAD4-/-＋PR组于术前输注野生型C57BL/6小鼠中性粒细胞。

48h后取材，进行三类评价：①血栓评价(测量血栓长度/湿重，免疫荧光检测MPO/CitH3共定位以评估NETs，蛋白印迹检测CitH3表达)；②NETosis评价(外周血中性粒细胞通过流式和免疫荧光检测NETs；骨髓中性粒细胞经四种不同刺激后通过免疫荧光检测NETs形成)；③组学评价(分析外周血细胞亚群、转录组差异及中性粒细胞-单核细胞交互作用)。

(1)与BLK组相比，APS-MG组小鼠静脉血栓负荷增加，表现为血栓长度(0.59±0.03cm)与湿重(0.54±0.04g)显著升高；PAD4-/-组的血栓长度(0.23±0.02cm)和湿重(0.17±0.02g)较APS-MG组降低，抑制剂GSK484组与APS-MG组相比血栓长度和湿重也出现下降趋势，回输野生型小鼠中性粒细胞可部分恢复血栓表型，差异具有统计学意义(P < 0.05)；免疫荧光与Western Blot结果显示，APS-MG组血栓内MPO/CitH3共定位率(22.95%)及CitH3蛋白相对表达量(0.95)较PAD4-/-组(1.13%、0.12)或GSK484组(5.72%、0.22)显著上调，差异具有统计学意义(P <0.05)。证实中性粒细胞是PAD4介导促栓效应的核心效应细胞。

(2)体外细胞实验结果显示，APS-MG组外周血中性粒细胞MPO/CitH3共定位率（38.36%）显著高于PAD4-/-组(7.42%)及GSK484组(15.42%)，差异具有统计学意义；骨髓来源的中性粒细胞在PMA、APS-IgG、NH-IgG及1640培养基诱导条件下，PAD4-/-组和GSK484组NETs形成率均显著低于APS-MG组，且回输野生型中性粒细胞后，NETs形成能力部分恢复，差异具有统计学意义；证明PAD4是驱动APS相关NETs形成的关键限速酶。

(3)单细胞测序结果显示，PAD4敲除显著降低中性粒细胞与单核细胞比例并重构其转录谱；差异基因GO与KEGG富集分析表明PAD4敲除可显著抑制单核细胞I型干扰素信号、天然免疫活化及中性粒细胞溶酶体功能、炎症趋化与代谢相关通路；细胞通讯分析揭示PAD4敲除显著削弱中性粒细胞单核细胞间双向配体受体信号交流。

本研究从遗传学、药理学及细胞生物学多层面证实，PAD4是通过介导NETs形成驱动aPL诱导血栓的关键限速酶。其机制涉及对中性粒细胞和单核细胞转录程序、代谢通路及细胞间互作网络的协同性与系统性抑制。PAD4特异性抑制剂GSK484可有效干预NETs形成并减轻血栓负荷，为APS新型治疗策略提供了坚实的实验依据。