摘要
骨关节炎（OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，目前有效的治疗手段有限。近期研究证据表明，衰老的滑膜成纤维细胞（FLSs）会促进骨关节炎的发展。低强度脉冲超声（LIPUS）是缓解OA安全有效的康复物理因子。本研究旨在探索LIPUS通过影响衰老成纤维细胞缓解OA的作用及其内在分子机制。
建立了内侧半月板不稳定手术诱导的OA小鼠模型，评估LIPUS治疗不同时间点对小鼠疼痛行为学（双足不平衡实验、旷场实验）和病理表型（HE染色、番红固绿染色、免疫荧光）的影响。进一步通过体外培养OA患者滑膜组织块、构建过氧化氢诱导的成纤维细胞衰老模型和LPS诱导的炎性巨噬细胞模型，利用β-半乳糖苷酶染色、WB、免疫荧光染色、代谢组学、单细胞测序分析以及其他细胞分子生物学方法等技术，评估LIPUS对成纤维细胞衰老的影响、巨噬细胞腺苷相关代谢物及信号通路的影响。
2、4及8周的LIPUS康复治疗有效缓解了OA小鼠的疼痛、滑膜炎和软骨丢失。此外，LIPUS能抑制OA小鼠以及OA患者膝关节滑膜组织中β-半乳糖苷酶活性、p16+PDGFRα+衰老FLSs比例。LIPUS显著缓解了OA小鼠滑膜和OA患者滑膜组织块中的FLSs衰老表型，但LIPUS并未直接抑制体外培养的FLSs的衰老表型，而LIPUS减弱了炎症巨噬细胞的条件培养基对FLSs的促衰老作用，提示LIPUS抑制滑膜FLSs衰老的作用是间接的，可能通过滑膜巨噬细胞发挥抗衰老作用。进一步的非靶代谢组学发现LIPUS能提高炎性巨噬细胞的腺苷水平，腺苷由腺苷代谢关键酶CD73介导生成，我们利用滑膜组织样本及单细胞公共数据库分析发现OA滑膜巨噬细胞低表达CD73，而LIPUS能促进炎性巨噬细胞中CD73蛋白表达。此外，外源性腺苷和A2AR激动剂处理能抑制H2O2诱导的成纤维细胞β-半乳糖苷酶活性和p16蛋白表达。利用A2AR抑制剂ZM241385处理衰老成纤维细胞后，LIPUS抑制细胞衰老效应减轻。机制上我们还发现A2AR腺苷受体的激活增加了p-AMPK和Sirt1蛋白表达。这些数据表明：LIPUS减弱了炎症巨噬细胞的培养上清对FLSs的促衰老作用，该作用依赖于A2AR/p-AMPK/Sirt1腺苷受体的激活。
研究结果表明，LIPUS能通过抑制滑膜成纤维细胞的衰老来减缓OA病程，LIPUS的抗衰老作用由滑膜炎症巨噬细胞通过CD73依赖性的腺苷生成介导，机制和滑膜成纤维细胞中的腺苷/A2AR/AMPK/Sirt1信号通路的激活有关。
