引用本文: 丛林, 张碧凝, 谢立信. 眼表及角膜疾病基因治疗的研究进展 [J] . 中华眼科杂志, 2023, 59(8) : 666-672. DOI: 10.3760/cma.j.cn112142-20221007-00502.

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基因治疗是一种应用特殊方法（如基因枪、电穿孔和离子导入等）或载体（如质粒、病毒和纳米颗粒等）将DNA或RNA等遗传物质递送到靶细胞的治疗方法，以调节细胞内的靶基因表达，并从根源发挥治疗作用。基因替换、基因沉默、基因添加和基因编辑是较为常见的基因治疗策略 ^［ 1 ］。随着CRISPR/Cas9技术的问世，基因编辑与临床治疗之间的距离变得更近了 ^［ 2 ］。新开发的单碱基编辑技术使基因编辑更加安全。该技术可以在不破坏双链DNA结构的基础上进行单个碱基修正，并适用于非增殖细胞，使得基因编辑可以适用于更广泛的细胞和组织范围 ^{［ 3 , 4 ］}。近期开发的线粒体碱基编辑平台的问世，使得基因编辑的靶向基因组更加全面 ^［ 5 ］。

基因治疗面临着安全性、免疫源性和基因传递效率等多方面的挑战。然而，由于眼睛具有特殊的解剖结构和血视网膜屏障，靶向眼部组织的基因治疗方案很少会引起全身性炎症反应 ^［ 6 ］，从而具有较好的安全性。角膜组织位置表浅，相对于眼底组织而言更易操作、更便于观察，且角膜的无血管免疫赦免状态可降低病毒载体免疫源性并提高转染效率。此外，角膜体积相对较小，较低的病毒剂量就能发挥良好的转染效果。因此，角膜组织成为进行基因治疗的理想靶点。

然而，由于角膜两侧疏水中间亲水的结构特征，不同角膜分层的转染效率较难掌握，同时靶基因的表达量也难以精准控制；对于先天性角膜疾病，基因治疗的最佳干预时机也尚不清楚。因此，眼表及角膜疾病的基因治疗面临着很多挑战，需要更加深入的探索。本文总结了国内外针对眼表及角膜疾病进行基因治疗的最新研究进展，并对目前的研究现状进行了讨论。

一、眼部基因治疗递送载体的选择

基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体两种类型，针对不同类型疾病和治疗靶点需选择相应的治疗载体 ^［ 7 ］。在病毒载体中，细小病毒科单链DNA病毒重组腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）由于其安全、高效和低免疫原性的特点，目前成为临床应用最为广泛的载体 ^［ 8 ］。不同的AAV血清型具有不同的靶细胞亲和力，其中AAV2、AAV8和AAV9在眼部应用较为常见 ^{［ 9 , 10 , 11 ］}。AAV载体可通过刮除角膜上皮点眼、角膜基质注射、前房注射、玻璃体腔注射、脉络膜上腔注射和视网膜下注射等多种途径在眼部实现基因转染 ^［ 7 ］，转染后的目的基因几乎不与患者基因组整合，而是在靶细胞内形成双链游离基因结构 ^［ 7 ］。该结构使得目的基因能够在眼部稳定表达并发挥治疗作用，持续时间可长达3~17个月 ^{［ 10 , 11 , 12 , 13 ］}。然而，AAV的缺点在于不能承载过大的目的基因片段（<4.7 kb），但目前开发的高效双AAV传递策略极大地拓展了其应用范围 ^［ 14 ］。此外，重组腺病毒（adenovirus，AV）、慢病毒和单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）也在实验室和临床研究中得到广泛应用 ^{［ 15 , 16 , 17 ］}。在非病毒载体方面，脂质纳米颗粒已被证明可用于角膜组织基因递送 ^{［ 18 , 19 ］}。作为人工合成的基因治疗载体，其优势在于极低的免疫原性，并且还可以根据需求进行改造以获得特异性细胞亲和力和药物动力学，目前已经被批准用于临床试验。近期，一种新型的工程化病毒样颗粒载体已被开发出来，用于传递mRNA或蛋白质等基因编辑组件。该载体融合了病毒载体和非病毒载体的优点，并表现出较低的脱靶编辑风险。在遗传性视网膜疾病的动物模型中，已验证了该载体的有效性。

二、基因治疗在眼表及角膜疾病的临床前研究

眼表及角膜疾病种类繁多、病因复杂。临床上比较常见、治疗也较棘手的疾病主要包括遗传性角膜疾病、糖尿病角膜病变、角膜瘢痕、病毒性角膜炎和干眼等。目前，眼表及角膜疾病基因治疗的靶点主要集中在角膜组织，而泪腺组织仅占少数 ^［ 20 ］。下面简述常见眼表及角膜疾病的基因治疗进展。

（一）基因治疗在遗传性角膜疾病中的应用

角膜营养不良是一种遗传性疾病，多为双眼发病，主要表现为角膜透明度降低和形态改变，可能导致视力丧失。该疾病多由单个基因突变引起，已发现与该疾病相关的基因有14个 ^［ 21 ］。同一基因的不同突变位点也可能导致不同类型的角膜营养不良，如与转化生长因子β诱导蛋白（transforming growh factor B induced protein，TGFBI）相关的角膜营养不良。TGFBI与角膜正常生理过程密切相关，已知其基因有70多个突变位点，其中R124C、R124H、R124L、R555Q、R555W等是比较常见的突变位点。这些突变位点会导致上皮下和浅基质淀粉样蛋白沉积，进而影响上皮和基质的营养代谢，但具体作用机制和沉积物性质尚未完全明确 ^［ 22 ］。亚洲人群更容易患颗粒状角膜营养不良 ^［ 23 ］，而欧美人群更容易患格子状角膜营养不良 ^［ 24 ］。部分患者可能会出现复发性角膜上皮糜烂和刺激症状，严重影响视力。即使通过准分子激光治疗性角膜切削术治疗，该病仍然会反复发作，最终可能需要进行角膜移植手术。因此，靶向TGFBI的基因治疗具有广阔的应用前景，其中基因沉默和基因编辑策略是治疗该疾病的首选方法。

Yuan等 ^［ 25 ］和Courteny等 ^［ 26 ］分别利用高特异性的shRNA和siRNA进行筛选，并在体外细胞系和原代角膜营养不良上皮细胞中进行转染，发现对异常TGFBI表达具有较高的沉默效率。Baran-Rachwalska等 ^［ 27 ］则开发了一种有机多孔硅纳米颗粒载体ProSilic，通过局部点眼的方式高效递送靶向TGFBI R124H突变的siRNA至角膜，发挥治疗作用。ProSilic载体在细胞内降解产物原硅酸是细胞正常代谢所需的无毒微量元素，从而保证治疗安全性。除了基因编辑和基因沉默外，在视网膜色素变性治疗中已经成功地应用了基因添加策略 ^［ 28 ］。然而，基因添加无法抑制异常显性基因表达，因此在角膜显性遗传疾病中的应用仍需进一步验证。

上述体外实验研究未得到体内进一步验证，主要原因是缺乏理想的动物模型。Lukassen等 ^［ 29 ］利用含有R124H突变的人类TGFBI基因导入小鼠TGFBI基因第1个外显子，建立了R124H转基因角膜营养不良小鼠模型。该模型突变TGFBI蛋白表达量占总TGFBI蛋白的41%，但并未观察到蛋白沉积现象。另一项研究由Kitamoto等 ^［ 30 ］采用CRISPR/Cas9技术，建立了TGFBI-R124C格子状角膜营养不良小鼠模型。80%纯合子小鼠和9.1%杂合子小鼠在40周龄时表现出角膜混浊。虽然无法通过裂隙灯显微镜观察到角膜内淀粉样蛋白沉积，但透射电镜观察到了基底膜附近不规则非晶态沉积物。因此，该模型可以在一定程度上作为角膜营养不良的动物模型。

Fuchs角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD）是内皮型角膜营养不良中最常见的临床表现之一，多个基因突变位点已被发现参与了其发病过程。研究表明，70%以上的FECD发病与转录因子4基因（transcription factor 4，TCF4）内含子CTG重复扩增序列异常表达有关 ^［ 31 ］。Rong等 ^［ 32 ］提出了一种干扰CTG重复序列表达的方法，即通过体外脂质体和慢病毒载体向FECD患者原代角膜内皮细胞递送包含CRISPR-dCas9和靶向TCF4基因重复序列的小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）质粒，使含有异常下游RNA团簇的细胞数量减少至1/10，并且不影响正常TCF4基因的表达。COL8A2基因错义突变是另一种导致早期FECD的原因 ^［ 33 ］，Uehara等 ^［ 34 ］通过单次前房注射靶向突变COL8A2基因启动密码子的包含Cas9和sgRNA的腺病毒载体，成功降低了角膜内皮细胞中的突变COL8A2基因的表达，从而避免了FECD的发生。

（二）基因治疗在糖尿病角膜病变中的应用

糖尿病角膜病变是长期血糖控制欠佳继发的获得性眼病，可能与高糖继发角膜缘干细胞功能异常和角膜神经损伤密切相关 ^{［ 35 , 36 ］}。早期仅表现为轻微眼部不适，但持续进展会出现角膜上皮缺损、新生血管和瘢痕，继发角膜基质融解、变薄，甚至角膜穿孔 ^［ 37 ］。糖尿病还会引起泪腺和睑板腺功能异常，诱发干眼并加重损伤 ^［ 38 ］。临床上主要依据Semeraro等 ^［ 39 ］的分期对糖尿病角膜病变采取分阶段治疗，主要为“对症”而非“对因”治疗。创新性的基因沉默和基因添加策略有望从根源治疗糖尿病角膜病变。

靶向角膜缘干细胞功能异常上，Saghizadeh团队研究发现糖尿病患者角膜金属蛋白酶10基因（matrix metalloproteinase 10，MMP-10）、组织蛋白酶F基因（cathepsin F，CTSF）表达增多，肝细胞生长因子受体c-MET基因表达减少 ^{［ 40 , 41 ］}。shRNA沉默MMP-10和CTSF可增强体外器官培养角膜角膜缘干细胞标记物表达 ^［ 42 ］，缩短角膜上皮的损伤修复时间 ^［ 43 ］。该团队还筛选出一种能与抑制c-MET基因的微小RNA（microRNA，miRNA）特异性结合的反义核苷酸，以脂质体为载体导入靶细胞后可上调其c-MET表达并加速角膜上皮损伤愈合 ^［ 44 ］。通过重组AV载体递送外源性c-MET基因，在靶细胞过表达c-MET基因后同样加速器官培养角膜上皮损伤愈合，并使角膜缘干细胞标志物表达趋于正常 ^［ 45 ］。

靶向神经损伤修复上，miRNA-204-5p靶基因SIRT1是糖尿病患者神经保护和创伤愈合的关键基因，抑制miRNA-204-5p/SIRT1可加速高糖环境下角膜上皮细胞循环，促进糖尿病角膜上皮损伤修复 ^［ 46 ］。进一步发现miR-182是SIRT1下游效应因子，借助质粒向糖尿病小鼠模型导入外源性miR-182可促进三叉神经感觉神经元神经突生长，降低靶基因Nox4表达而刺激角膜神经再生，减轻高血糖对角膜神经损伤并促进角膜感觉恢复 ^［ 47 ］。通过对糖尿病和正常小鼠三叉神经节进行RNA测序，发现miR-350-5p/Mup20、miR-592-5p/Angptl7、miR-351-5p/Elovl6等miRNA/mRNA对之间存在密切相互作用，参与糖尿病角膜病变发病 ^［ 48 ］。

糖尿病角膜病变目前多局限在miRNA相关基因治疗，其优势在于：单个miRNA可以与多个目的基因3′端非翻译区结合下调靶基因表达；短链核苷酸序列便于miRNA靶向药物设计和批量生产；miRNA较容易通过多种传递途径进入细胞发挥作用。很多miRNA治疗方案已获批开展临床试验 ^{［ 49 , 50 ］}。但是，miRNA治疗也存在一些问题：使用大数据筛选的miRNA精确率仅为26% ^［ 51 ］，筛选高效、高特异性的miRNA需一系列体内外实验来验证；miRNA还有一定的不可预测性，多种miRNA可同时参与正常生理过程和病理过程，甚至在同一疾病发生过程中显示不同数据，较难获得稳定的效果 ^［ 52 ］。因此，精准筛选miRNA并保证其在靶细胞中稳定发挥作用，是miRNA基因治疗的重点和难点。目前过表达外源性目的基因在糖尿病角膜病变的相关研究较少，可能与尚未找到特异、高效的治疗靶点有关，且糖尿病角膜组织功能欠佳，外源目的基因表达效率和持续时间也有待确认。随着治疗靶点和高效载体的不断筛选，糖尿病角膜病变的基因治疗可能有更广泛的应用。

（三）基因治疗在角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）中的应用

角膜的透明性取决于其无血管状态。然而，感染、外伤、神经受损等情况下，CNV可能会出现。CNV会破坏正常的角膜微环境，是继发角膜混浊和角膜移植排斥的重要原因。当局部糖皮质激素、非甾体抗炎药、免疫抑制剂、抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物、酪氨酸激酶抑制剂等常规治疗无法控制CNV时，手术干预是必要的 ^［ 53 ］。基因治疗是一种极具潜力的CNV治疗方法，其中基因添加和基因沉默策略被广泛研究和应用。

Su等 ^［ 10 ］发现，与重组AAV2相比，小鼠角膜基质注射重组AAV8的转染效率提高了3倍。单次注射过表达VEGF融合蛋白KH902的重组AAV8可持续3个月以上，并显著抑制碱烧伤和缝线刺激的CNV模型的生长。在兔微袋CNV模型中，Mohan等 ^［ 54 ］通过角膜基质注射将核心蛋白聚糖（decorin，DCN）基因应用AAV5载体传递至角膜基质细胞，有效下调了VEGF、单核细胞趋化蛋白1和血管生成素的表达，同时上调了色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）的表达。Hirsch等 ^［ 55 ］构建了一种携带密码子优化人白细胞抗原G（human leucocyte antigen，HLA-G）基因的AAV8载体，单次注射于兔角膜基质内，发挥持续的抗新生血管作用，抑制T淋巴细胞浸润并减少肌成纤维细胞的生成。除了靶向角膜组织外，Nominato等 ^［ 56 ］还选择泪腺作为基因治疗靶点，在重组AV载体的传递下，将可溶性FMS样酪氨酸激酶-1（soluble FMS-like tyrosine kinase-1，sFLT-1）传递至碱烧伤大鼠模型的泪腺，显著减轻了CNV程度。在治疗后7 d，sFLT-1表达已经在腺泡中检测到，且未在血液中检测到sFLT-1抗体，证实了泪腺作为基因治疗靶点的安全性。除了病毒载体，还有一种水脂两亲性SAINT-18凝胶载体，携带PEDF基因质粒，通过结膜下注射可在大鼠基质囊袋CNV模型中使角膜和结膜组织中PEDF高效稳定表达超过3个月 ^［ 57 ］。

基于RNA的基因沉默策略也有一系列与实验室相关的研究。使用固体脂质纳米颗粒携带MMP-9 shRNA，可以在体外培养的人角膜上皮细胞中实现30%的沉默效率 ^［ 58 ］。同时，携带miRNA-204的重组AAV在小鼠角膜碱烧伤模型中，通过多种途径（Angpt1/Tie2/PI3K/Akt）下调炎症因子的释放，减少CNV的形成 ^［ 59 ］。由于基因沉默策略需要严格筛选高特异性和高效的RNA，因此这类研究目前还处于实验室阶段。

（四）基因治疗在角膜瘢痕中的应用

外伤、感染、化学伤或角膜屈光手术可能继发角膜纤维化形成角膜瘢痕，角膜基质细胞增生活跃是引起纤维化的重要因素，临床尚缺乏有效的应对方案。近年来基因治疗作为角膜纤维化的新兴疗法受到广泛关注，基因添加和基因沉默是首选策略。

Tang等 ^［ 60 ］在大鼠角膜板层创面模型中验证了iPSC-MSC-Exos/CHI水凝胶对基质损伤和瘢痕的作用。iPSC-MSC-Exos是一种由诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞分泌的外泌体，其中包含miR-432-5p，可抑制易位相关膜蛋白2的表达，从而预防细胞外沉积物的聚集。该外泌体与热敏壳聚糖基水凝胶结合后，局部应用于大鼠角膜板层创面，可下调COL1A1、COL5A1和COL5A2 mRNA的表达，促进角膜上皮和基质的修复，并减轻角膜纤维化的程度。在准分子激光诱导的兔角膜纤维化模型中，Mohan团队分别向角膜基质注射携带DCN基因和SMAD7基因的重组AAV5载体，4周后发现纤维化相关蛋白的表达降低，角膜混浊显著减轻且未引起角膜免疫反应 ^{［ 61 , 62 ］}。将SMAD7基因与聚乙烯胺偶联金纳米颗粒整合（PEI2-GNP），局部点眼后即可发挥与AAV载体转染类似的效果 ^［ 63 ］。骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）通过拮抗转化生长因子-β信号传导抑制纤维化进程，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）通过c-MET和转化生长因子β通路促进肌成纤维细胞凋亡，从而减轻纤维化的程度。PEI2-GNP携带BMP7和HGF双基因也能明显恢复角膜透明度、减轻肌成纤维细胞过度愈合和选择性凋亡 ^［ 64 ］。双基因治疗对严重角膜损伤有更好的疗效，但其传递效率较单基因治疗低，基因导入后表达的稳定性也不够，因此仍需要验证其长期的安全性和稳定性。

（五）基因治疗在HSV性角膜炎中的应用

HSV感染是全球范围内比较普遍的病毒感染之一。HSV性角膜炎是由HSV-1引起的一种常见疾病，其病程常常反复，会导致角膜变薄、新生血管和瘢痕，其致盲率和发病率在感染性角膜病中排名第一 ^［ 65 ］。基因编辑和基因沉默策略为HSV治疗提供了新选择。

Yin等 ^［ 66 ］开发了一种靶向HSV基因组的、基于CRISPR/Cas9基因编辑慢病毒载体。该载体可同时递送SpCas9 mRNA和针对病毒基因的sgRNA。研究团队验证了该载体在体外细胞系模型、3种不同小鼠HSV性角膜炎模型和体外培养的人角膜组织上对HSV-1复制的抑制作用。该载体还可通过神经逆行传输至三叉神经节并清除潜伏的HSV-Ⅰ。由于基因编辑工具以mRNA形式递送，因此基因编辑酶Cas9在体内停留时间短，可明显降低脱靶效应并减少免疫反应，相关临床试验仍在积极开展（NCT04560790）。该团队后续尝试CRISPR/Cas9靶向人角膜上皮细胞主要HSV受体黏附蛋白-1（Nectin-1）。在转染角膜上皮细胞系后，研究团队成功降低了Nectin-1基因的表达，从而显著降低了HSV的感染率 ^［ 67 ］。基于miRNA的HSV基因沉默治疗方案也有尝试。Li等 ^［ 68 ］筛选了靶向HSV复制基因ICP4的ICP4-siRNA，并结合多种溶剂（如脂质体、高分子胶束、聚乙烯亚胺等）进行点眼抑制HSV复制。此外，还有很多miRNA靶点也参与HSV致病过程，但相关研究目前仅局限于角膜HSV，缺乏针对三叉神经潜伏HSV的研究，相关后续研究仍需开展 ^［ 68 ］

HSV虽然可引起疾病，但其嗜神经性和主动神经传输能力使其有望成为优秀的基因治疗载体。最新研究发现，HSV主动神经传输能力与病毒在神经微管上快速移动所依赖的细胞内蛋白引擎有关 ^［ 69 ］。目前，重组HSV载体已被应用于治疗营养不良型大疱性表皮松解症和遗传性鱼鳞病，并取得了良好的治疗效果 ^{［ 17 ， 70 ］}。然而，在眼部应用中，重组HSV载体可能会引起局部毒性反应，并存在激活潜伏HSV的风险 ^［ 71 ］。因此，构建重组HSV病毒载体的难点在于精确敲除其自我复制和细胞毒性相关基因，以及保留其主动传输功能并能够携带目的基因。

（六）基因治疗在干眼中的应用

干眼是一种由多种因素引起的慢性眼表疾病，其发病机制可能与泪膜稳定性下降或眼表微环境失衡有关。此病可伴有眼表炎性反应、组织损伤及神经异常等症状。患者通常会出现明显的眼部刺激症状，长期未得到有效控制可能导致角膜上皮损伤并引起继发感染。许多自身免疫疾病，如Sjögren综合征、类风湿关节炎和红斑狼疮等，容易引起干眼，其发病机制可能与免疫调节性T细胞和B细胞功能异常有关 ^［ 72 ］。基因添加是治疗这类疾病的首选策略，特殊细胞因子具有抗炎作用，是干眼基因治疗的靶点。

Trousdale等 ^［ 73 ］采用重组AAV介导肿瘤坏死因子α抑制基因转染泪腺组织的方法，诱导构建自身免疫性泪腺炎兔模型。治疗后1周，目的基因蛋白在泪液中检测到，4周后泪液分泌恢复正常，同时角膜上皮损伤修复速度加快。该团队随后发现，重组AAV介导IL-10基因可明显降低角膜CD18+细胞数量和CD4+/CD8+细胞比例，从而减轻局部免疫反应 ^［ 74 ］。Dias等 ^［ 20 ］使用苯扎氯铵诱导大鼠干眼模型，将重组AAV过表达人促红细胞生成素基因转染唾液腺和泪腺。结果表明，转染后大鼠泪液分泌增加，而唾液腺转染后血液红细胞压积升高，泪腺转染后无明显异常。这可能与目的蛋白在唾液腺过表达后可通过消化系统吸收，而泪腺过表达目的蛋白后眼表吸收极少有关。此外，该结果也说明了泪腺作为治疗靶点的安全性。干眼患者眼表MUC5AC表达量明显降低，而Contreras-Ruiz等 ^［ 75 ］则将编码改良MUC5AC蛋白的质粒与阳离子化明胶纳米颗粒结合，点眼给干眼模型小鼠治疗后发现，CD4+细胞浸润减少、泪液分泌增加、炎症减轻。

虽然目前干眼基因治疗相关研究较少，但泪腺为眼表和角膜疾病治疗提供了新的靶点。腺体外包膜可将泪腺组织与其他眶内组织隔离，靶向泪腺组织导入目的基因可通过腺体细胞表达分泌至眼表，发挥治疗作用。这种治疗方法不仅避免了角膜基质注射引起的局部损伤，还解决了功能异常病变角膜转染后无法正常表达目的基因的问题。不过，对于靶向泪腺的基因治疗，需关注目的基因过表达引起的局部安全性问题。

三、展望

近年来，眼表和角膜疾病基因治疗在实验室研究中取得了显著进展，但进一步的临床应用还需要大量的基础研究支持。基因治疗的前提是安全性，其基础是高效的载体，关键则在于规范的评估标准。在基因治疗和基因编辑策略的实施中，必须在伦理委员会的严格监督和监管下进行。对于一些过去需要密切随诊、反复调整治疗方案的疾病，现在可能通过一次或几次基因治疗维持疗效，即使对于依从性差的患者也能受益。这样不仅能提高患者的就诊体验，而且还能极大程度减轻医疗系统的负担，让更多有需要的患者得到及时救治。虽然目前基因治疗的费用偏高，但随着新的载体开发和制作工艺的改进，大规模流水线化生产可大大降低成本，减轻患者经济负担。

眼表和角膜疾病基因治疗起步和发展虽然相对于视网膜疾病和其他系统性疾病较晚，但具有其独特的优势。眼表和角膜疾病基因治疗有着广泛的应用市场，这将不断推动其更快、更安全地向临床应用转化，为患者带来新的希望。