聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑

这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。

本期与我们见面的是复旦大学附属中山医院姜帅教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Molecular Cancer》杂志（影响因子：37.3）的前列腺癌的表观转录组学研究。

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研究背景

前列腺癌是全球男性发病率和死亡率第二大肿瘤^[1]。核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）修饰在转运RNA（transfer RNA，tRNA）中普遍存在。在人体内，tRNA N7-甲基鸟苷（N7-methylguanosine，m7G）甲基化复合物主要由甲基转移酶1（Methyltransferase 1，METTL1）和调节蛋白WD重复域蛋白4（WD Repeat Domain 4，WDR4）组成。tRNA m7G修饰可选择性地调节特定转录本的翻译，在病理过程中，METTL1表达增加可能与肿瘤侵袭性相关。越来越多的证据显示表观转录组标记在许多肿瘤的发生过程中发挥重要作用；然而，目前人们对表观转录组沉积改变在前列腺癌中的作用和意义知之甚少。因此，本研究旨在探究RNA修饰在前列腺癌进展过程中的作用^[1]。

研究材料

人前列腺细胞系和前列腺癌细胞系选用PC3、DU145、VCaP、C4-2、22Rv1、LNCap、BPH1、RWPE1、PWR-1E和HEK293FT细胞系。小鼠选用无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级裸鼠。与患者签署知情同意书后获取前列腺癌组织样本。

研究结果

● 在人和鼠前列腺癌中，METTL1升高

原发性和转移性前列腺癌中最显著的差异表达基因是METTL1（图1B）。人类前列腺癌从原发性到转移性进展过程中，METTL1和WDR4表达持续增加（图1C）。研究发现METTL1和WDR4表达与磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylin ositol 3 kinase，PI3K）增强通路激活显著正相关（图1E），表明METTL1和WDR4在晚期前列腺癌中表达增加。结果证明METTL1是前列腺癌进展过程中主要的表观转录组调节因子，其过度表达与不良预后相关（图1）。

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图1 在前列腺癌中METTL1表达上调

● METTL1表达受AKT‑mTOR下游信号通路调节

数据集分析结果显示METTL1和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）表达呈显著负相关（图2A），提示PI3K-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）轴调节前列腺癌中METTL1的表达。

使用小分子抑制剂BKM-120抑制剂、MK2206、雷帕霉素和Torin分别抑制PI3K、AKT、mTORC1和mTORC1/2通路，进一步解析PI3K-mTORC1/2轴，结果显示抑制AKT通路可降低METTL1信使RNA（messenger RNA，mRNA）水平，抑制mTOR通路可降低METTL1 mRNA和蛋白表达（图2B-C），证明METTL1的表达通过mTOR信号通路调节。结果证明，METTL1是mTORC1通路的下游效应因子，mTORC1激活可诱导METTL1表达增加（图2）。

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图2 PI3K-AKT-mTORC通路介导前列腺癌中METTL1表达上调

● METTL1优先促进tRNA甲基化

使用抗m7G抗体的North-dot blot分析和质谱分析证实METTL1敲除（knockout，KO）细胞tRNA中m7G缺失（图3B-C）。然后，通过AlkAnaline-seq以单核苷酸分辨率绘制m7G图谱，并使用METTL1 KO细胞tRNA作为对照。高通量测序数据分析证实了鸟苷46可变环的强烈甲基化（图3D，F）。研究者确定约50%所有同源受体为METTL1底物（图3E，G）。结果证实，METTL1优先促进前列腺癌细胞tRNA在可变环甲基化（图3）。

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图3 METTL1优先促进tRNA甲基化

● METTL1介导的甲基化保护tRNA不被剪切成小的非编码RNA

分析PC3野生型（wild type，WT）和METTL1 KO细胞的小RNA测序数据，结果显示，在PC3 METTL1 KO细胞中检测到5′tRNA片段持续富集（图4B）；然而，与WT细胞相比，大多数在METTL1 KO细胞中显示富集适度增加（图4C）。

将一小部分tRNA剪切成tRNA来源的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）是对应激的保守反应，tRNA修饰保护它们免受应激诱导的剪切。在应激反应过程中，METTL1 KO细胞中的tRNA裂解比WT细胞更显著，早在氧化应激暴露2 h后达到峰值，并在应激刺激8 h后下降，可能是由于不能解决应激导致细胞死亡增加（图4G，H）。

综上，METTL1介导的甲基化是一种保护机制，在前列腺癌细胞的应激反应过程中，调节来源于5′tRNA片段的一类新的小ncRNA的生物发生，与它们的遗传状态无关。

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图4 tRNA中m7G甲基化缺乏导致5’tRNA片段积累

● METTL1缺失通过tRNA片段的生物合成抑制翻译起始

与WT细胞相比，METTL1 KO细胞中真核翻译起始因子4G（eukaryotic initiation factor 4G，eIF4G）和多聚腺苷酸结合蛋白1（polyadenylate-binding protein 1，PABP1）的m7G-caps亲和力显著降低（图5B），表明5′TOG的积累增加使翻译起始复合物的一些因子的组装和结合帽不稳定，导致METTL1 KO细胞的翻译受到抑制。

转染5′TOG的WT细胞中PAPB1与m7G-caps的结合被取代，但转染anti-TOG RNA的METTL1 KO细胞中PAPB1的m7G-caps亲和力显著增加（图5D）。

综上，在METTL1 KO细胞中表达的5′TOG可以取代mRNA帽中的翻译调节因子，并在METTL1介导的翻译抑制的分子基础中产生关键作用。

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图5 在体内，METTL1下调抑制蛋白质合成、增殖和肿瘤生长

● 在体外和体内，METTL1下调抑制前列腺癌生长

与用空载体（empty vector，eV）转染的KO细胞相比，重新表达WT METTL1的METTL1 KO 细胞的增殖和球体形成能力增加。相反，催化失活突变体的表达不能促进METTL1 KO细胞生长和球体形成能力（图5M-N）。

为了进一步确定5′TOG是否可诱导前列腺癌细胞生长停滞和凋亡，用5′TOG转染PC3 WT细胞，用anti-TOG转染METTL1 KO细胞，并测定细胞凋亡和增殖。结果显示，当WT细胞转染5′TOG RNA时，细胞凋亡显著增加，增殖减少；当METTL1 KO细胞转染anti-TOG时，细胞凋亡减少（尽管不显著），增殖显著增加（图5O，P）。

综上，METTL1失活和5′TOG是诱导生长停滞所必需的。

● METTL1缺失激活干扰素（interferon，IFN）信号通路

METTL1 KO细胞多核糖体组分中mRNA富集的分析显示，与干扰素信号转导相关的特异性转录本翻译增加，如干扰素调节因子9（interferon regulatory factor 9，IRF9）和干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15，ISG15）（图6D）。

此外，还在METTL1 KO细胞和异种移植物中观察到信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）的蛋白表达和磷酸化增加（图6E），然而其表达增加与翻译增加无关（图6D）。STAT1敲除后PC3 METTL1 KO细胞凋亡减少，增殖增加（图6F，G），表明METTL1抑制的抗增殖作用可部分通过激活STAT1信号通路介导。

综上，在前列腺癌细胞中，METTL1的表达与IFN通路的激活呈负相关，METTL1抑制翻译可激活IFN信号通路。

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图6 m7G tRNA甲基化缺失导致不同的翻译程序

● 前列腺癌中METTL1低表达与促炎免疫细胞极化增加相关

在METTL1 KO细胞中，促炎细胞因子（包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF]和肿瘤坏死因子α[tumour necrosis factor α，TNF-α]）分泌增加（图7A），使巨噬细胞向M1样巨噬细胞分化。

敲除METTL1可诱导抗炎细胞因子（包括巨噬细胞或集落刺激因子[macrophage or colony stimulating factor，M-CSF]、白细胞介素10[interleukin 10，IL10]和白细胞介素13[interleukin 13，IL13]）下调（图7A），可使巨噬细胞极化为M2样巨噬细胞。

为了验证体内研究结果，使用免疫组织化学分析人前列腺癌中免疫细胞组成。分析显示M2样巨噬细胞浸润和METTL1表达之间存在显著的直接相关性，M1样巨噬细胞浸润呈负相关趋势，CD8+T细胞浸润与METTL1表达呈负相关（图7E）。

综上，在体外，抑制前列腺癌细胞中METTL1的表达可以产生细胞毒性免疫反应。在人前列腺癌中，METTL1低表达与肿瘤微环境中肿瘤内细胞毒性免疫细胞的增加有关。

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图7 前列腺癌中METTL1低表达与细胞毒性浸润增加和免疫检查点抑制剂治疗应答良好有关

● METTL1抑制增强前列腺癌对免疫检查点抑制剂治疗的应答

Pten-KO小鼠前列腺上皮METTL1杂合缺失（Pten-KO/Mettl1+/-）和METTL1条件性缺失（Pten-KO/Mettl1flox/flox）导致腹叶和前叶的肿瘤体积显著减小，在Pten-KO/Mettl1+/+小鼠中更大（图7F）。

用抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTL4A）抗体处理小鼠，与未处理小鼠相比，免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）处理后Pten-KO/Mettl1+/+小鼠肿瘤体积未减小，而ICB处理后Pten-KO/Mettl1flox/flox小鼠肿瘤体积显著减小（图7I）。

在乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤患者中，ICB治疗应答者的METTL1表达低于ICB治疗无应答者，表明METTL1高表达预示着患者对ICB治疗应答较差（图7J）。

综上，METTL1表达水平可以决定肿瘤内细胞毒性免疫浸润和ICB治疗的成功。

研究结论

本研究证实METTL1在前列腺癌中过度表达，并且分析了其致癌作用。另外，通过tRNA片段合成发现了一层新的表达调控和选择性翻译控制。通过抑制METTL1介导的甲基化，能够增加一类新的ncRNA（5'TOGs）的生物合成，它可以调节肿瘤细胞中IFN通路的激活。此外，抑制肿瘤细胞中的METTL1导致细胞毒性免疫细胞浸润增加，从而将肿瘤微环境由免疫抑制型转化为肿瘤杀伤型。这些结果表明，单独靶向METTL1或与ICB联合具有开发有效治疗策略的巨大潜力，特别是对于治疗选择有限的去势抵抗性前列腺癌患者。

专家有话说

本项研究为我们提供了大量的体外试验与体内试验数据，证实了METTL1介导的m7G转运RNA甲基化在前列腺癌的翻译控制和肿瘤进展中起到了非常重要的作用，而且它对未来的新型ICB治疗方案可能具有一定的预测作用。然而，目前ICB治疗方案尚未达到令人满意的结果，以曲普瑞林为代表的雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）仍是前列腺癌患者的基石治疗。

今年6月曲普瑞林6月剂型在中国获批，使我国患者同时拥有1月、3月、6月三种不同剂型选择，有利于前列腺癌患者管理。一项真实世界、回顾性的、非介入DESERVE研究^[2]，纳入了88例接受曲普瑞林6月剂型治疗的转移性前列腺癌患者，其中47例初始接受曲普瑞林6月剂型治疗，41例由促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist， GnRH-a）1月/3月剂型更换为曲普瑞林6月剂型治疗。在治疗12个月时，初始接受曲普瑞林6月剂型治疗患者中位PSA从诊断时的23.50 ng/mL下降为1.30 ng/mL，更换为曲普瑞林6月剂型治疗患者中位PSA从换药时的0.35 ng/mL下降为0.24 ng/mL^[2]，曲普瑞林6月剂型对初治和转药患者均可有效降低PSA。

最后，回顾本研究结果，其有利于帮助研究者探索如何能将前列腺癌由免疫冷肿瘤转化为对免疫治疗应答率更高的免疫热肿瘤，对未来更多的前列腺癌治疗探索具有一定的提示作用，期待本研究的结果可以转化到临床实践中，为前列腺癌患者带来获益。

专家简介

姜帅教授

复旦大学附属中山医院

复旦大学附属中山医院泌尿外科，医学博士，副主任医师，副教授，硕士生导师

复旦大学附属中山医院泌尿外科副主任

复旦大学附属中山医院泌尿外科膀胱癌亚专科主任

复旦大学附属中山医院吴淞医院泌尿外科学术主任

2013-2014 美国加州大学戴维斯分校肿瘤中心 Assistant Professor

中国医师协会泌尿外科分会青年委员

中国医师协会器官移植医师分会青年委员

上海市医学会泌尿外科专科分会青年委员会副主任委员

中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会青年委员会委员

中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会前列腺癌学组委员

中华医学会泌尿外科分会青年委员会传播学组委员

海医会泌尿外科专委会青委会委员

上海中西医结合学会泌尿男科微创学组委员

擅长泌尿系统肿瘤等疾病的微创诊治，特别是膀胱癌、前列腺癌和肾癌的机器人微创手术治疗。曾获全国青年泌尿外科医师腹腔镜操作技能大赛冠军（CUA与EAU联合举办）及全国优秀手术视频比赛一等奖。专注于泌尿生殖系统肿瘤的基础研究，主持多项自然科学基金，以第一作者或通讯作者发表论文20余篇，单篇最高IF39.3，参编专著5本，申请国家发明专利6项，国家实用新型专利3项，获批国家发明专利1项、国家实用新型专利3项。

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