科学研究是为了造福人类，创造美好生活。目前，全世界范围有很多干细胞实验室，致力于研究各项生物技术，使人类免除病痛折磨，提供更好的生活质量。

吕红斌教授在第18届IFOSMA大会上就《材料、干细胞与骨腱界面损伤修复》进行演讲报告，围绕干细胞与材料结合修复受损的骨腱界面等主题，与各位同仁分享研究成果，展望未来损伤修复新趋势！

骨腱界面损伤

骨腱界面损伤是最常见运动损伤，涉及骨与肌腱/韧带起止点。

临床好发部位：肩关节肩袖、膝关节前/后交叉韧带、踝关节内外侧韧带等。

骨-腱界面有四层结构，分别是骨、钙化的纤维软骨、未钙化的纤维软骨、肌腱。

骨腱界面的组成成分、结构排列和力学性能具有梯度渐变的特点，是其主要特征。

随着手术方式及术后康复治疗、生物治疗策略不断改进，骨腱界面损伤修复取得了很大的进步，但损伤后的骨腱界面仍无法快速完全地恢复正常层次结构，表现为：生物力学性能差、基质成分及结构紊乱、纤维瘢痕愈合，导致患者早期运动功能恢复不佳，其修复效果仍难以让人满意。

因此，如何促进骨腱界面损伤后层次结构快速优质再生是运动医学界亟待解决的临床难题。

组织工程材料

现如今，组织工程的发展策略侧重于模拟天然骨腱界面的微观结构以及复杂的细胞及其生存微环境，我们可以通过材料的优化设计和修饰来部分实现正常骨腱界面梯度结构的仿生。

另外，针对再生微环境中内源性干细胞的探索也给设计骨腱界面损伤后组织的原位有序再生策略提供了新的思路。其远期的应用发展主要集中于：生物材料设计、种子细胞优化和生长因子控释这三个方向。

其中，支架的构建一直都是关注的重点之一。一方面，损伤修复需要材料能够模拟正常骨腱界面的结构特征，实现形态和力学性能的梯度渐变仿生。

另一方面，支架应具有良好的生物相容性，特别是具备优越的材料-细胞交互性能，能够促进内源性干细胞定向分化，并分泌特定的细胞外基质，从而形成梯度渐变的组织结构，实现原位再生。

组织工程研究采用的支架来源主要包括天然材料，人工合成材料，和去细胞材料，他们互有优劣。

但毫无疑问的是，新兴发展的组织工程支架均以模拟天然骨腱界面结构为首要设计目标，主要包括材料的硬度、表面拓扑形态、多层支架设计、支架组织成分等多个维度。

常用加速去细胞及增加孔隙率的方法

与生物合成材料相比，整块骨腱界面去细胞组织工程支架具有高致密性和空隙少等确定点，使得种植的细胞常局限于支架表面，需要较长时间才能迁入去细胞支架内部，因此学者们采用激光打孔、切片，微粒等方法来增加孔隙率并加速去细胞。

但这些处理方式将使得支架整合困难，不便用于体外组装及手术植入。

那么，如何更好的利用组织工程技术，制备去细胞基质材料，探索促进运动系统损伤愈合的新型干预策略？

修复策略①

创新性修复“书页”状支架材料

吕红斌教授团队创新性地设计“书页”原理的组织薄片切割方法，将待去细胞的组织预先切割成书页状，不仅有效地克服了单层组织薄片的局限性，可显著加速细胞迁入支架内部生长，同时缩短去细胞处理时间，又避免了去细胞处理对细胞外基质活性成份流失的影响。

此外，该形态支架还能够方便复合种子细胞及手术植入。2014年团队获得了“新型骨-软骨-肌腱三相书页支架对骨腱连接点损伤后梯度结构再生的作用及相关机制研究的”面上项目课题的立项，近8年来团队一直致力于骨腱界面损伤的组织工程修复策略研究。

随着研究的不断深入，吕红斌教授团队尝试实现去细胞支架材料仿生设计的目标，来模拟骨腱界面的梯度渐变特性。

团队将获取的骨、纤维软骨和肌腱组织分别制成易于吸收的薄片书页状支架后，进行去细胞处理，在去除大部分细胞成分的基础上，最大限度地保留原组织的微观结构和基质成分。

最为重要的是，本研究根据天然骨腱界面梯度渐变的结构、成分特征，将去细胞骨、软骨、肌腱这三种支架进行堆叠组装，从而构建结构与成分仿生的去细胞三相书页支架。

相比于单一组织来源的支架，三相支架具有诸多设计优势。该项工作在发表在生物材料的权威杂志Biomaterials上。

一方面，该三相仿生支架能够高度模拟正常骨腱界面结构，保留有绝大部分的纤维蛋白、蛋白多糖等基质，维持与生理情况相似的力学环境。

另一方面，该支架中包含的骨、纤维软骨和肌腱均保留有优良的生物相容性，且能定向诱导骨髓来源间充质干细胞向不同谱系定向分化。

通过构建去细胞三相书页支架-骨髓间充质干细胞片复合体并将其植入兔髌骨-髌腱界面损伤模型，团队从组织学、影像学、生物力学等多个维度证明采用多相材料堆叠的去细胞支架能够实现骨腱界面中骨、软骨和肌腱的有序再生。

修复策略②

创新研制负压吸引去细胞装置

现有的去细胞支架材料制备常常采用物理结合生物的方法，或者化学结合生物的方法，甚至还有采用物理、化学、生物三类方法的混合应用。

物理、化学、生物方法各有所长，混合应用可以取长补短，实现缩短去细胞时间、更好的保留组织细胞基质形态结构。

但是这些混合应用的方法，步骤繁多，且存在ECM蛋白结构变性及丢失率高的缺点。因此，仍需要不断优化现有去细胞方案。

吕红斌教授团队研发了一种新型负压吸引去细胞装置，借助负压吸引装置，驱动去细胞试剂的循环流动，快速洗脱并吸引出组织内细胞物质，并更好的保留组织原有细胞外基质成分。

利用负压吸引去细胞装置制备软骨去细胞支架，与传统去细胞方案制备的软骨支架对比，蛋白质谱检测证实负压吸引脱细胞装置更好的保留了细胞外基质构成蛋白，表现为蛋白丰度更高、蛋白种类保留更多。

证实我们的去细胞方法作用更加温和、高效。该脱细胞方案已经获得国家发明专利。通过不断优化装置参数，我们通过一种自主设计的负压吸引装置，冲洗并吸出组织内细胞物质，从而制备出形态结构、力学性能仿生性更佳的生物材料。

该研究成果发表在2020年转化医学年鉴杂志（Ann Transl Med）上，获得了同行的高度评价和引用。

修复策略③

创新应用细胞片技术

对于种子细胞的移植方法，目前常常采用高浓度细胞悬液或者支架材料负载，其中，高浓度续保悬液法获取细胞时，需要经过胰酶消化处理，常常导致细胞外基质丢失，并且移植细胞靶向滞留于损伤处困难。

然而，支架材料载体法同样需要胰酶处理细胞，依然不能有效保留细胞外基质，同时还存在支架上细胞分布不均等问题。

近年来，一种新的细胞种植技术（即细胞片技术）有效的避免了上述问题，经该技术所获得的细胞片呈现完整的片状结构，含有大量的种植细胞和细胞外基质，有着传统组织工程种子细胞种植方法不可比拟的优势。

吕红斌教授团队在兔跟腱缺损处和髌骨髌腱损伤处植入去细胞肌腱书页支架复合骨髓间充质干细胞片，体内研究发现能够促进肌腱胶原纤维和骨腱界面再生，及生物力学性能的恢复，这为跟腱损伤和髌骨髌腱损伤的治疗提供了有效的方法，相关研究成果分别于2019年和2021年发表在骨科权威杂志JOR和JOT上。

针对单纯去细胞支架中细胞成分丢失、易于降解、难以再生命化的痛点，团队前期制备了一种形态结构仿生、成软骨诱导性能优良的去细胞纤维软骨书页支架，并与自体脂肪间充质干细胞片合体组装，制备具有一定生命力的组织工程纤维软骨移植物，我们的结果证实去细胞支架复合自体干细胞的治疗策略能够显著促进纤维软骨层的再生。

修复策略④

结合胶原结合特性生长因子等

生物活性物质

对于提升去细胞骨腱界面书页支架诱导活性，外源性生物活性物包括生长因子、小分子药物、外泌体等，其中生长因子也是最常见。

传统的外源性生长因子引入支架的方法主要包括：直接浸泡、水凝胶材料、缓释微球等。但是，这种方法负载生长因子数量有限，同时植入体内后因子呈现爆发状释放，造成修复区域早期因子浓度过高，不利于种子细胞稳定生长分化。

近年来，纳米凝胶及缓释微球广泛应用于生长因子负载，它们提高生长因子负载量的同时还避免了生长因子爆发式释放，是一种较好的负载缓释方法。

但是，纳米凝胶及缓释微球制备需要多种高分子人工合成材料，这些材料的引入势必会影响去细胞骨腱界面书页支架的天然形态结构，从而影响支架的仿生性能。

学者们证明血管破裂时，血管内皮细胞下胶原暴露与血液，血液中血管性血友病因子（vWF）特异性结合胶原，启动凝血过程。

在这个过程中，学者们证实vWF中A3区域是结合胶原的关键。那么，该预期由于具有胶原结合能力，也成为胶原结合域。

受此启发，我们将利用大肠杆菌原核表达体系将CBD序列添加入SDF-1α序列N端，合成一种融合型SDF-1α。从而使其具有胶原结合能力和细胞募集能力。

JOR, 2020,

IF:3.494,通讯作者

吕红斌团队的实践侧重于提升细胞因子与支架的附着能力，希望以此实现细胞因子在材料上的稳定负载和缓慢释放。

基于已经广泛应用的胶原结合肽的设计和基因工程技术的应用，课题组制备了一种具有高胶原亲和力的基质细胞衍生因子1α（简称C-SDF-1α），并将其粘附在书页状去细胞纤维软骨基质的胶原纤维上，从而构建了一种可持续募集干细胞并具备成软骨诱导活性的去细胞纤维软骨基质移植物，结果证明该移植物具有促进髌骨髌腱损伤的修复作用。该研究成果发表在2020年JOR上。

Biomaterials, 2020,

IF:12.479, 通讯作者

通过进一步深入研究，该团队将该移植物植入大鼠肩袖损伤模型，待炎症反应消退后，于关节腔注射CXCR4阳性滑膜间充质干细胞，发现移植物可以通过缓释SDF-1α，并募集注射的外源性干细胞迁入肩袖止点损伤局部，参与巨大肩袖撕裂后的修复过程。

Biomaterials, 2020,

IF:12.479, 通讯作者

此方案简化了支架体外负载细胞的步骤，一定程度上保障了植入细胞的存活率，为开发骨腱界面组织工程治疗方案提供了一种新模式，有利于临床推广应用。该项工作在2020年发表在生物材料的权威杂志Biomaterials上，并收到学界的赞扬。

Am J Sports Med, 2021,

IF:6.202, 通讯作者

另外该团队也通过基因工程技术制备了一种具有高胶原亲和力的骨形态发生蛋白-12（简称C-BMP-12），并将其粘附在书页状去细胞肌腱支架上，从而构建了一种可促进干细胞成肌腱分化的去细胞肌腱书页支架移植物，结果表面该移植物可大大促进大鼠跟腱损伤愈合的作用。

该研究成果发表在2021年美国运动医学杂志（AJSM）上。

Front Cell Dev Biol, 2021,

IF:6.684, 通讯作者

同时，不仅在骨腱界面损伤领域，在皮肤创面修复方面吕教授团队也进行了探索研究，通过制备携带缓释碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与脂肪间充质干细胞片的书页去细胞真皮支架移植物，可以有效地促进糖尿病创面愈合修复。

Am J Sports Med, 2019,

IF:6.202, 通讯作者

另外团队也进行了和厚朴酚和淫羊藿苷等中药小分子化合物与去细胞支架的结合，探究了生物活性物质的缓释效应，相关成果分别于2019年和2020年发表在美国运动医学杂志（AJSM）上。

修复策略⑤

骨腱界面支架

及区域性诱导活性强化研究

组织工程的早期研究主要采用单一相的生物支架促进骨腱界面损伤修复，然而骨腱界面是一种由骨、软骨、肌腱三层组织构成。单一相的生物支架明显在仿生特性上存在不足。

近年来，国外学者利用PLGA材料模拟正常骨腱界面骨-软骨-肌腱结构制备了三相组织工程移植物用于促进骨腱界面再生。此外，还有学者模拟骨腱界面矿物质梯度特点，制备了矿物质梯度渐的支架以促进骨腱界面梯度结构的再生。

此外，课题组前期使用反向交叉堆叠法将上述去细胞骨、纤维软骨、肌腱书页支架模仿骨腱界面三层结构堆叠构建了一种新型骨-纤维软骨-肌腱三相去细胞支架，并将骨髓间充质干细胞片包夹于书页间隙，体内实验结果显示该三相支架易于机体内化吸收，具有优良地促进骨腱界面组织层次结构再生的性能。

遗憾的是，该新型支架仅实现了骨腱界面形态结构的仿生，未能实现生物力学特性的仿生，特别是植入体内早期不具备抗牵拉性能，存在移植物三层结构裂开及移位风险。

因此，制备一种形态结构高仿生、具有抗牵拉力学性能的支架对于骨腱界面层次结构再生意义重大。

为此，吕红斌教授团队拟吸取“书页”状组织薄片切割方法的优势，改变切割方向，将正常骨腱界面组织块沿着力学牵拉方向由肌腱向骨方向进行切割，获取骨腱界面书页支架，经去细胞处理，制备去细胞骨腱界面书页支架。

这种方法不但有利于加速骨腱界面组织去细胞，保留组织原有形态结构，避免胞外基质成份丢失，特别是生物活性成份的丢失；而且还能保障去细胞支架具有优良的牵拉力学性能；从而为骨腱界面损伤修复提供了一种形态结构与力学性能双重仿生支架。

该团队首先明确组织学染色明确犬冈下肌肌腱止点肌腱束的平均直径（约为200um)。随后，根据肌腱束的平均直径，设置150、200、250、300 um后，拉断实验明确最小厚度。

同时通过自主研发的新型负压吸引去细胞方案对切割塑形后的支架进行去细胞处理，相对于传统去细胞方案吕教授团队的新型方案效率更高、细胞外基质保留更佳。

随后，通过HE及上海光源傅里叶红外线成像技术对去细胞前后的支架进行评估，研究表明新型负压吸引去细胞方案相对于传统去细胞方案能保留更多的胶原及蛋白聚糖。

团队通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与质谱分析发现新型负压吸引去细胞方案组不仅在总量上保留了更多的细胞外基质蛋白，而且在数量上相对于传统去细胞方案组也更多。

随后，团队进行了支架的抗牵拉力学性能评估，结果显示新型去细胞组相对于传统组具有更好的拉断载荷与刚度。

通过同步辐射微束荧光分析技术检测支架内钙、磷元素的含量及分布差异。结果显示该处理方法实现了形态结构、构成成份、抗牵拉力学性能仿生。

该研究通过大肠杆菌原核表达体系合成胶原特异性结合的BMP-2（CBD-BMP-2）、胶原特异性结合的TGF-β3（CBD-TGF-β3）和胶原特异性结合的GDF-7（CBD-GDF-7），分离纯化后，分别与去细胞骨腱界面书页支架的骨、纤维软骨、肌腱区域进行特异性结合，使得支架骨、纤维软骨、肌腱区域分别具有较强的干细胞成骨、成软骨、成肌腱诱导性能，并实现生长因子的缓释。

从而促进骨腱界面损伤修复后骨、纤维软骨层、肌腱三层组织再生。新型支架具有以下三大优点：1、模拟正常骨腱界面骨-软骨-肌腱三相结构；2、具有组织形态及抗牵拉力学性能双重仿生特性；3、区域干细胞定向诱导特性。

为了进一步确认上述因子在体外控制释放能力，实验中用不同的荧光染料标记了各种因子，将实验组与对照组标记荧光的因子特异性地拴入去细胞的骨区，纤维软骨区，肌腱区。

随后，在PBS中水平振荡，每三天，在荧光显微镜下观察支架中标记的各项荧光因子的残留物。

荧光图像显示，胶原结合特性生长因子结合的去细胞支架适合作为BMP-2、TGF-β3和GDF-7区域特异性释放的控制递送系统。

构建新型组织工程骨腱界面移植物

犬冈下肌肌腱止点骨腱界面损伤模型

（对应临床巨大肩袖撕裂模型）

种子细胞及其移植方式作为组织工程支架的另一重要部分，直接分化为修复器官/组织，分泌修复组织类似的细胞外基质。

目前在骨腱界面再生领域，骨髓、滑膜、脂肪间充质干细胞作为常用种子细胞具有较高地分化为骨、软骨、肌腱细胞的潜能，并且具有获得容易、增殖迅速、来源广泛、低免疫原性及细胞干性稳定等优点。

然而这些种子细胞的获取往往需要对宿主产生损伤，因此，本研究采用尿源干细胞作为种子细胞，并制备成尿院干细胞片用于移植。

团队将上述新型骨腱界面组织工程移植物用于犬冈下肌肌腱止点骨腱界面损伤模型。随后在相应时间点对比格犬进行了肩袖部位的MRI检查，并在术后第12个月进行CT、组织学及生物力学方面的检查。

活体情况下MRI评估犬冈下肌

肌腱止点骨腱界面再生情况

术后3个月，对照组及移植物组犬冈下肌肌腱止点骨髓水肿及周围软组织肿胀基本消失，但对照组止点组织成像密度仍明显高于对移植物组止点。

离体标本利用μCT评估犬冈下肌

肌腱止点损伤处骨新生情况

移植物组标本止点处新生骨重塑较对照组更加明显，表现为骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）较对照组明显增加。

离体标本利用组织学评估犬冈下肌

肌腱止点损伤处骨腱界面再生情况

移植物组，67.64%的再生止点组织呈现出正常骨腱止点四层结构，而对照组，仅有38.82%的再生止点组织呈现出正常骨腱止点四层结构。组织学评估表打分结果显示实验组评分明显高于对照组。

离体标本利用拉断测试评估犬冈下肌

肌腱止点损伤修复组织抗牵拉力学性能

实验组及对照组标本分别恢复了70.14%、53.67%的拉断载荷，且实验组较对照组恢复的更明显。此外，新型移植物组样本刚度同样明显优于对照组样本。

本项目成功制备了“区域”干细胞诱导活性强化的书形高仿生骨腱界面支架，将其包夹自体尿源干细胞片，构建了新型骨腱界面组织工程移植物，体内证实其具备良好地促进巨大肩袖撕裂修复的作用，有望为开发新的组织工程骨腱界面再生策略提供强有力的实验依据。

吕红斌 教授

中南大学湘雅医院运动医学科

一级主任医师

二级教授、博士生导师

运动医学国家临床重点专科带头人

器官损伤衰老与再生医学

湖南省重点实验室主任

运动与健康湖南省

工程研究中心主任

中华医学会运动医疗

专业委员会委员

中国医师协会运动医学

医师分会常务委员

运动康复专业学组组长

湖南省医学会运动

医疗专业委员会主任委员

吕教授先后主持国家自然科学基金重点项目及面上项目、湖南省重点领域研发计划、长沙市重大科技专项、高等学校博士学科点专项科研基金等各类科研项目30余项，获湖南省自然科学奖二等奖、湖南省科技进步三等奖、华夏医学科技奖三等奖、ORS年会上荣膺“2016 Excellence in Basic Science Award”，迄今发表SCI论文80余篇，成果发表在Bioactive Materials、Biomaterials、Elife 、ACS Appl Mater Interfaces、Molecular Therapy、Am J Sports Med等知名期刊。主编和参编专著9部。获国家发明专利9项，实用新型专利3项。

编辑：与佳

校对：秋月

审核：吕红斌教授

投稿邮箱：yunyiqianyan@qq.com

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