目的：

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是由自身抗体介导的获得性神经-肌肉接头（neuromuscular- junction，NMJ）传递障碍的自身免疫性疾病。乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体是最常见的致病性抗体，除乙酰胆碱受体抗体外，抗连接素抗体（Titin 抗体）抗体可见于97%以上伴胸腺瘤的重症肌无力患者和40%-50%晚发的 MG 患者体内，作为一种伴随抗体，Titin 抗体的致病机制虽然尚不明确，但Titin 抗体与 MG 的临床严重程度具有更好的相关性。因此 Titin 抗体的检测对伴胸腺瘤 MG 和晚发型 MG 患者的临床和愈后研究具有重要意义。

目前实验室对 Titin 抗体的检测方法主要是 ELISA，其优点为灵敏度高，可以对抗体进行定量检测，但 Titin 抗体 ELISA试剂盒首先依赖进口，国内在此方面的发展较慢，其次，实验过程中终止液需要硫酸，显色成分造成污染，第三，ELISA 无法实现抗体的可视化。基于细胞的测定（cell-based assay, CBA）技术在神经免疫学诊断中的引入代表了真正的突破。与 ELISA 相比，CBA 使用在细胞膜上高表达的天然折叠蛋白进行检测构象敏感的自身抗体。这种优势意味着抗体检测的灵敏度大大增加，因为抗体的一部分可以在自身免疫环境中优先识别严格依赖于蛋白质三级-四级结构保存的不连续表位。

本研究利用基因工程合成 Titin 抗原，即 MG 胸腺瘤特异性30 KD 抗原（MGT30），建立Titin 抗体的 CBA 检测方法，并在此基础上，对 MG 患者血清中 Titin 抗体 进行检测，与 ELISA 检测结果进行比较，从而建立起 Titin 抗体的 CBA 检测方法。

材料与方法：

本研究共纳入2021年4月到2022年6月间的患者血清564例，ELISA 试剂盒检测 Titin 抗体 ，阳性血清161例，阴性血清403例。

构建 Titin 抗体主要免疫原区MGT30蛋白表达质粒pcDNA3.1-MGT30并验证。

pcDNA3.1-MGT30转染HEK293细胞，WB验证MGT30蛋白的真核表达。

pcDNA3.1-MGT30转染HEK293细胞，转染效率达到60%以上进行后续实验，处理细胞，抗体血清孵育，洗涤，加入Alexa Flour594标记的抗人二抗，抗体洗涤，荧光显微镜观察血清中抗体与抗原结合情况（红色荧光与绿色荧光）。通过上述方法对 564 例血清进行筛选，并对部分阳性和阴性结果的血清进一步WB验证。

结果：

双酶切实验结果表明pcDNA3.1-MGT30构建成功，WB结果验证pcDNA3.1-MGT30转染HEK293细胞后，MGT30蛋白表达成功。

荧光显微镜观察结果：Titin 抗体阳性患者血清中的Titin 抗体与HEK293细胞表达的MGT30蛋白结合，Alexa Flour594标记的抗人二抗与Titin 抗体结合，显现的红色荧光可与质粒携带的EGFP标签蛋白实现共定位。对照组及阴性血清的无红色荧光，WB进一步验证，与CBA结果一致，提示Titin 抗体检测的CBA方法建立。

564例血清CBA筛选，CBA结果为阳性161例，阴性403例，564例血清筛选结果与ELISA结果一致，从中选取20例血清进行WB验证，进一步验证与CBA结果一致。

结论：

本研究通过构建Titin 抗体特异性抗原 MGT30 表达质粒pcDNA3.1-MGT30，转染 HEK293 细胞表达 MGT30 蛋白，抗体后成功建立 Titin 抗体 的 CBA 检测方法，与ELISA方法比较，并初步进行血清检测应用。与 ELISA 检测方法相比，CBA 自主性更高，污染更小，并且可以实现抗原抗体结合的可视化，为指导 Titin 抗体阳性患者临床诊疗和预后判断提供了新的检测方案。